支原体检测方法的选择（一）

       支原体（mycoplasma）于1898年发现，是一种无细胞壁且能独立生存的单细胞微生物，也是可用人工培养基培养增殖的最小原核细胞型微生物。

       支原体结构比较简单，无细胞壁，只有三层结构的细胞膜，故具有较大的可变性。大小介于细菌和病毒之间，为0.1～0.3μm，故能通过滤菌器。支原体基因组为一环状以双链DNA，分子量小（仅有大肠杆菌的五分之一），合成与代谢很有限。         肺炎支原体的一端有一种特殊的末端结构（terminalstructure），能使支原体粘附于呼吸道粘膜上皮细胞表面，与致病性有关。

（革兰氏染色不易着色，故常用Giemsa染色法将其染成淡紫色。）

       支原体体积微小，可以通过细胞过滤器，是生物制品的最常见外源因子污染物之一。因此在检查中常存在检测难、去除难、观察难等三大困难。《中国药典》2020年版3301中关于支原体检查法中规定了两种检测方法：培养法和指示细胞培养法（DNA染色法）。

1.培养法

       培养法即接种待检样品于固体培养基或液体培养基，在一定条件下培养，如有支原体，固体培养基上可观察到“荷包蛋”状支原体菌落；液体培养基则会因为支原体数量达到一定程度影响pH值而与指示剂产生颜色反应而被检出。

       固体培养法是最原始的方法，简单直观，缺点是后来发现有很多支原体难以在固体培养基上形成菌落，容易造成假阴性结果；液体培养基则能弥补固体培养基的缺陷，但是检测经常受到指示剂加入量、变色范围较小等因素的干扰。因此液体培养法和固体培养法通常一起使用，使检测结果更加可靠。培养法的检测周期较长，一般在28天左右，不能快速检出。

       将待检样本接种于指示细胞（无污染的Vero细胞或经国家药品检定机构认可的其他细胞）中培养后，用特异荧光染料（如Hoechst染料）染色。支原体污染，会在细胞表面或者培养基中见到大小不等、不规则的荧光着色颗粒，与细胞核呈现的椭圆形、更大更亮荧光形成鲜明对比。

       与支原体培养法相比，突出优点是结果简单直观，可以检测到不易培养支原体，例如M.hyorhinis，约7-14天可得到结果。缺点有假阳性、假阴性的可能，比如在细胞粘附性比较差的支原体（精氨酸类支原体），染色法的检出效果较差；支原体污染不严重时容易得到模棱两可的结果，只有在污染严重时才能得到可信度高的结果。

       以上就是《中国药典》2020年版3301中关于支原体的两种检测方法。值得注意的是，在对主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞进行支原体检查时，应同时进行培养法和指示细胞培养法（DNA染色法）。病毒类疫苗的病毒收获液、原液采用培养法检查支原体；必要时，亦可釆用指示细胞培养法筛选培养基。

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