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mRNA疫苗，即信使核糖核酸疫苗，是一种革命性的疫苗技术，它利用人体自身的细胞机制产生抗病原体的免疫反应。与传统疫苗相比，mRNA疫苗不直接注入病原体的成分或灭活形式，而是提供一段编码特定病原体抗原（如病毒表面蛋白）的mRNA。一旦进入人体细胞，这段mRNA被细胞的蛋白质合成机制读取，指导细胞制造出相应的抗原蛋白[2]。这些抗原随后被免疫系统识别为外来物质，触发体液免疫和细胞免疫反应，从而在不引起疾病的前提下建立起针对特定病原体的免疫记忆。
2023年10月2日，2023年诺贝尔生理学或医学奖授予卡塔琳·考里科和德鲁·韦斯曼，以表彰其“在核苷碱基修饰方面的发现，使得开发有效的针对COVID-19的mRNA疫苗成为可能[3]。”
•高效性：mRNA疫苗能迅速诱导强烈的免疫应答，尤其在面对快速变异的病毒时表现出优越性。
•灵活性：设计和生产速度快，易于调整针对新出现的病毒株。
•安全性：不含有病原体，不会在人体内复制，降低潜在副作用风险。
mRNA疫苗的生产涉及多个复杂步骤，大致可以分为以下几个阶段：
1.序列设计：基于目标病原体的基因序列，设计mRNA序列，包括编码抗原的开放阅读框（ORF），以及必要的5'帽和3'poly(A)尾巴以确保翻译效率和mRNA稳定。
2.质粒构建：通常使用DNA环状质粒，将设计好的目的序列模块构建到质粒上，其中包括刺突蛋白编码。利用电刺激法将环状DNA质粒转入大肠杆菌。此后，进行大肠杆菌的繁殖扩增。提取并纯化DNA质粒，利用酶将纯化后的环状DNA质粒切割为链状。
3.mRNA合成：通过体外转录（IVT）技术大规模合成mRNA，通常使用噬菌体或植物病毒的RNA聚合酶，以DNA模板生产mRNA。
4.纯化与修饰：合成的mRNA需经过多步纯化去除杂质，并通过化学修饰（如加入假尿嘧啶核苷酸、甲基化等）增加其稳定性和减少免疫原性。
5.脂质纳米颗粒（LNP）制备：为了保护mRNA免受体内降解，并促进其细胞摄取，需要将其封装入脂质纳米颗粒中。这一步骤包括脂质混合物的配制、mRNA与脂质体的复合，以及最终纳米颗粒的形成。
6.配方与灌装：将制得的mRNA-LNP悬浮液进行最终配方处理，调整pH值和渗透压，然后进行无菌灌装到注射器或小瓶中。
7.质量控制与稳定性测试：整个生产过程伴随着严格的质控，包括用于制造mRNA疫苗的每一批质粒DNA，都必须在释放前进行测试，以确认其身份、纯度和质量；以及mRNA完整性、LNP粒径分布、效力与安全性测试，以及长期稳定性研究。
（mRNA疫苗生产工艺流程图）
mRNA药物原料和成品表征和放行检验的质量属性方法[4]
表1：质粒DNA质量属性
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质粒DNA质量属性USP<1040>章节 |
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质量属性 |
分析程序 |
验收标准示例 |
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外观——颜色和清晰度 |
目视检查 (631)或Ph.Eur2.2.2 |
透明，无色溶液，但可能是分子和/或工艺特定的 |
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可见微粒 |
〈790〉,c〈1790〉d, Ph. Eur. 2.9.20, Ph. Eur.2.9.19 |
无可见微粒 |
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pH |
(791) |
最终特定用途 |
|
浓度 |
A260 |
最终特定用途 |
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分子排阻HPLC |
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鉴别 |
限制性内切酶图谱 |
与理论图谱或参考图谱相同 |
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测序 |
与参考序列相同 |
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同源区域的识别，包括长末端重复序（LTRs）， 反向末端重复序列（ITRs ），和多聚(A)尾 |
限制性内切酶图谱 |
这些区域的完整性应被理解为整体体控制策略的一部分。 |
|
PCR |
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测序 |
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质粒DNA拓扑结构 |
琼脂糖凝胶电泳 |
标准应该是特定于最终使用的。这里有一些可能的兴趣属性：控制适当的百分比总超卷曲与低百分比的开圆形，线性和其他形式 |
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阴离子交换（AEX）HPLC |
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毛细管凝胶电泳（CGE） |
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分析性超离心 |
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电子显微镜 |
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蛋白残留 |
比色法（例如二喹啉甲酸法（BCA），Lowry] |
最终特定用途；1-10%（w/w） |
|
宿主细胞蛋白酶联 免疫吸附试验（ELISA） |
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宿主DNA残留 |
定量聚合酶链式反应（PCR） |
最终特定用途；1-10%（w/w） |
|
宿主RNA残留 |
琼脂糖凝胶电泳（AGE）与适当的染色 |
最终特定用途；1-10%（w/w） |
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用荧光法测定RNA的荧光标记 |
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|
反相HPLC 反转录酶-聚合酶链式反应 |
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|
抗生素残留 |
ELISA |
最终用途；考虑患者和环境安全 |
|
质谱法 |
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反相HPLC |
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|
细菌内毒素 |
<85>9 |
最终特定用途；≤10-100EU/mg |
|
微生物限度 |
<61> |
最终用途；一般，≤1 CFU/10 mL |
|
无菌 |
<71> |
没有增长[注:生产规模可能使按< 71 >抽样变得困难详细信息请参见5.1.12微生物限度和无菌] |
|
支原体 |
<63> |
不应存在于微生物产生的质粒DNA中。测试是可选的，取决于应用程序。可能是排除人为污染的必要条件。 |
表2：mRNA药物原料表征和放行检验
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质量 |
属性 |
方法 |
|
鉴别 |
mRNA序列鉴定确认 |
高通量测序（HTS） |
|
桑格测序 |
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|
逆转录-PCR（RT-PCR） |
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浓度 |
RNA浓度 |
定量逆转录PCR（RT -qPCR） |
|
逆转录数字PCR（RT-dPCR） |
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|
紫外分光光度法（UV） |
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完整性 |
mRNA完整性 |
毛细管电泳 |
|
毛细管凝胶电泳（CGE） |
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琼脂糖凝胶电泳 |
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|
纯度 |
mRNA纯度 |
离子对反相高效液相色谱法（IP-RP-HPLC） |
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5‘加帽效率 |
反相液相色谱质谱（RP-LC-MS/MS） |
|
|
离子对反相高效液相色谱法（IP-RP-HPLC） |
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|
液相色谱质谱法（LC-MS/MS） |
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|
3‘poly (A)尾长 |
液相色谱质谱法（LC-MS/MS） |
|
|
离子对反相高效液相色谱法（IP-RP-HPLC） |
||
|
产品相关杂质- dsRNA |
免疫印迹法 |
|
|
酶联免疫吸附试验（ELISA） |
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|
产品相关杂质-聚合体定量 |
分子排阻-高效液相色谱法（SEC-HPLC） |
|
|
产品相关杂质-片段mRNA的百分比 |
反相液相色谱法（RP-HPLC） |
|
|
工艺相关杂质-残留DNA模板 |
定量PCR（qPCR） |
|
|
工艺相关杂质-游离/非结合核苷的定量 |
反相液相色谱质谱（RP-LC-MS/MS） |
|
|
工艺相关杂质-残留的NTP和封盖剂 |
阴离子交换的高性能液体 |
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|
工艺相关杂质-残留的T7 RNA聚合酶含量 |
酶联免疫吸附试验（ELISA） |
|
|
效力 |
靶蛋白的表达 |
基于细胞的测定 |
|
安全 |
细菌内毒素 |
USP <85> |
|
微生物限度 |
USP <61>, <62>, <1115> |
|
|
其他 |
外观 |
USP <790> |
|
残留溶剂 |
USP <467> |
|
|
pH |
USP <791> |
表3 ：mRNA药物成品表征和放行检验
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质量 |
属性 |
方法 |
|
鉴别 |
RNA鉴定 |
桑格测序 |
|
逆转录酶-PCR（RT-PCR） |
||
|
带电气溶胶检测器的反相高效液相色谱法（RP-HPLC-CAD） |
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|
浓度 |
RNA浓度/RNA包封效率 |
荧光检测 |
|
磷脂含量 |
带电气溶胶检测器的反相高效液相色谱法（RP-HPLC-CAD） |
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完整性 |
LNP大小和多分散性 |
动态光散射（DLS） |
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RNA大小和完整性 |
毛细管凝胶电泳（CGE） |
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纯度 |
与产品相关的杂质-聚合体定量 |
分子排阻-高效液相色谱法（SEC-HPLC） |
|
产品相关杂质-片段mRNA的百分比 |
离子对反相高效液相色谱法（IP-RP-HPLC） |
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|
效力 |
靶蛋白的表达 |
基于细胞的测定 |
|
安全 |
细菌内毒素 |
USP <85> |
|
无菌 |
USP <71> |
|
|
其他 |
外观 |
USP <790> |
|
残留溶剂 |
USP <467> |
|
|
渗透压 |
USP <785> |
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|
可见异物 |
USP <787> |
|
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抽提体积 |
USP <1>, <698> |
|
|
容器封闭完整性 |
USP <1207> |
|
|
pH |
USP <791> |
参考文献
[1] Esparza J, Damaso CR. Searching for the origin of the smallpox vaccine: Edward Jenner and his little-known horsepox hypothesis. Vaccine. 2022 Jan 3;40(1):3-4. doi: 10.1016/j.vaccine.2021.11.007. Epub 2021 Nov 20. PMID: 34794823.
[2] mRNA疫苗及其作用机制的研究进展．中国知网
[3] 两位科学家分享2023年诺贝尔生理学或医学奖．人民日报
[4] mRNA疫苗和治疗方法质量的分析程序. USP
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