科研干货 | 支原体检测方法的选择（二）

前言       

支原体在检查中常存在检测难、去除难、观察难等三大困难。培养法和指示细胞培养法（DNA染色法）检测周期较长，不能满足那些保存有效期短的产品或需要快速放行的中间品，也不能满足药业大规模批量检测的实际情况需求，以及样本量大，操作困难等问题，寻求更高灵敏度、更快速、更合规的检测方式成为支原体检测技术开发的要旨。由此，也带来了另一个药品监管机构所关注的重要问题，即所用的方法是否具有与经典方法相同的灵敏度可以保证产品的安全性。目前研究较为完善的检测方式是支原体核酸扩增检测方法。

       核酸扩增检测方法（Nucleic Acid Amplification Technology, NAT）是通过扩增并检测特定的支原体基因组保守序列来进行支原体污染检测的方法。它具有快速、便捷、受样本类型影响小等特点，已成为实验室检测支原体污染的常用方法。包括以支原体核糖体16S-23S rRNA的特异保守序列设计引物建立的常规PCR、针对支原体特异性保守序列探针做荧光标记建立的荧光定量PCR，针对肺炎支原体P1基因设计的环介导等温扩增法（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP ）的肺炎支原体快速检测方法，检测支原体16S rRNA基因转录产物的RT- PCR法等。

       支原体NAT法优点是检测灵敏度高，特异性好，检测速度快，2-3小时出结果。但是，由于NAT方法检测支原体的能力依赖于扩增引物序列、不同的核酸提取方法、扩增反应体系及扩增程序等，这些都可能会对阳性样本的检出效率产生影响。其次，NAT方法检出的是支原体的基因组，无法鉴别样品中的支原体是否存活、是否为支原体相近种属的微生物污染等。NAT可以用作替代药典中两种方法的选择，因此，开展充分的支原体NAT法的方法学验证就显得十分必要，其验证结果也是使用者评估及筛选支原体NAT检测试剂的重要参数。

      特异性/专属性是指方法可检测出支原体，但是又不会检出与支原体无关的其他细菌或物质。因此，在验证过程中要关注是否有交叉反应，若有交叉反应，则需建立一个阳性结果的判定原则。影响特异性的因素主要有引物探针的选择和测试的条件。

耐用性是评估方法不被可能变化的参数变化而影响的能力，也就是评定此方法的稳健性，能够体现方法在日常使用中的可靠性。不同提取试剂、扩增体系、扩增程序以及检测所用设备的变化均能够为方法的耐用性评估提供参考数据。

欧洲药典对支原体NAT检测方法做出了补充，如果要使用NAT替代药典方法，还需增加可比研究（Comparability Study）对比确认NAT法能够替代培养法或者指示细胞培养法，通常需要考虑方法的检测限，同时也需要把专属性（如覆盖的支原体范围以及可能的假阳性）考虑进去。

       支原体污染是生物制品外源因子污染检查的经典话题,同样也是细胞治疗产品安全性质控的一项重要指标。NAT法因其快速准确的特点，能更全面评估生物制品中可能存在的支原体风险，是目前生物技术领域研发者用于检测细胞类产品和过程控制的放行主要检验方法。

       君研生物秉承倾力守护药物安全，助力医药产业发展的宗旨，将支原体NAT检测和验证的研发列入重点项目，自主研发了支原体DNA（qPCR）检测试剂盒，试剂盒专一性强、灵敏度高，可覆盖100多种支原体，且与密切相关的菌种无交叉反应！

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