E.coli表达中的RNA残留检测

表达系统中的E.coli

       蛋白表达系统是基因工程和生物制药的重要工具，其中原核蛋白表达系统既是最常用的表达系统，也是最经济实惠的蛋白表达系统。原核蛋白表达系统常以大肠杆菌表达系统为代表。大肠杆菌（E.coli）不仅具有遗传背景清楚、易于培养和控制、转化操作简单、表达水平高、成本低、周期短等特点，而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，因此大肠杆菌无论在学术界还是生物制药工业界都是一种最常用的重组蛋白表达系统。大量的生物制品如治疗性蛋白和工业化酶都使用大肠杆菌作为宿主来表达。

       在细胞治疗产品的生产中，质粒/Minicircle DNA是DNA疫苗产品的主要成分之一，同时也是病毒载体或非病毒载体细胞免疫疗法的重要原料。在质粒制备菌株的生产过程中，大部分都是利用大肠杆菌进行发酵的，通过碱裂解反应，可以纯化得到DNA产品，但是在碱裂解反应的过程中，大肠杆菌会有大量的RNA释放出来，并随机断裂形成大小不一的RNA碎片。生物制品中存在的RNA碎片会影响其生物学的活性，干扰质粒的转染表达效率；同时，RNA残留也会激活细胞干扰素通路引发免疫反应，对人体产生危害，因此需要建立RNA残留的定量检测方法，保证产品的质量和安全。

残留核酸检测技术

       目前中国药典2020版规定了三种残留核酸检测技术。

DNA探针杂交法

       第一种，DNA探针杂交法。原理是通过将单链吸附于固相膜上，与特异性标记的单链DNA探针杂交，使用与标记物相应的显示系统显示杂交结果，与已知含量的阳性DNA对照比对，显色深度反应DNA量。DNA探针杂交法的特点是准确度差、灵敏度低、检测结果不稳定、检测时间长。

荧光染色法

       第二种，荧光染色法。这种方法的原理是利用特异性荧光染料与双链DNA结合成复合物，在一定的DNA浓度范围内，荧光强度与DNA浓度成正比，用荧光酶标仪检测，根据荧光信号强度，计算DNA残留量。荧光染色法检测核酸的问题在于荧光信号易受干扰、特异性较差。

定量PCR法

       第三种，定量PCR法。通过荧光标记的特异性探针，监测体系中荧光数值的变化，即时反映特异性扩增产物量的变化。荧光强度达阈值时，PCR循环数与起始模板量的对数呈线性关系，采用已知浓度DNA标准品，构建标准曲线，就可以测定外源DNA残留量。测量结果灵敏度高特异性强。

       君研生物自主研发的E.coli 总 RNA 残留（qPCR）检测试剂盒配套有 E.coli RNA定量参考品，可快速准确定量检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中E.coli（DH5α、BL21 等）宿主细胞RNA残留量。

E.coli总RNA残留（qPCR）检测试剂盒

• 检测原理  

       君研生物经过严格的方法学验证，利用荧光探针的原理，自主研发的E.coli 总 RNA 残留（qPCR）检测试剂盒具有检测快速，专一性强，性能可靠等特点，试剂盒的线性范围为：200 pg /μL-0.002pg /μL，最低检测限为2 fg /μL。

• 性能指标  

①标准品线性：

试剂（盒）内用于绘制标准曲线的标准品包含6个浓度，包括线性区间上限200 pg /μL和下限2 fg /μL，R2=1，扩增效率Eff（%）=98%，各浓度检测值CV <15%。

标准品扩增曲线图（左）及标准曲线图（右）

②阴性参考品符合率：

NTC值为比曲线中最低点高2-3个Ct值左右。

③定量限：

 重复测定浓度为0.002pg /μL参考品10次后，计算其结果测量偏差及变异系数CV，测量偏差不大于|±20%|，CV <20%。

④试剂盒精密度：

 重复10 次检测2 pg /μL 和0.02 pg /μL 两个浓度参考物质各10 次，CV 值<15%。

⑤样品加标回收率检测：

用君研生物“宿主细胞残留DNA（磁珠法）样本前处理试剂盒”对100 μL样本进行核酸前处理，然后进行DNase 处理以消除 gDNA 对检测的影响，之后用E.coli 总RNA 残留（qPCR）检测试剂盒。

经验证，君研生物E.coli 总RNA残留（qPCR）检测试剂盒，回收率在70%-130%范围内。

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