生物制品中HCP残留的ELISA检测方法开发策略

目前，HCP（宿主细胞蛋白Host Cell Protein）的检测方法主要包括酶联免疫吸附法（ELISA）和液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS），前者具有操作简便、快速、高通量等特点，是各国药典推荐的在生物制品中检测残留HCP的方法。

本文主要基于USP<1132>章，从分析方法的开发周期、分析方法中主要试剂的制备与表征和分析方法的开发与验证等多方面，对HCP免疫分析检测方法的开发进行了解读。

一. 开发周期

当前，广泛被使用于HCP检测的方法是双抗体夹心酶联免疫法（ELISA），在药物研发中，通常会建立通用和专属的HCP ELISA方法。前期可以采用通用HCP ELISA试剂盒。到临床三期时，药企会采用专属试剂盒。

图1 双抗夹心法检测HCP示意图

HCP ELISA分析方法的开发计划应根据项目所处的不同阶段而定。在产品早期开发时，可以选择商品化HCP试剂盒，该分析方法通常可使用至临床二期（图2A）。临床三期及以后，应优选平台工艺HCP方法或上游工艺专属HCP方法。如果希望将商业化试剂盒应用于临床三期和上市后，则应充分证明试剂盒中主要试剂（如标准品、抗体等）适用于本工艺的HCP检测。考虑到试剂盒来自外部供应商，生物制品生产方对其控制较少，当关键试剂（如抗体）更换时，应当证明更换前后的方法一致性。

平台工艺HCP方法是指使用公司特定的宿主细胞株，按照上游平台工艺生产的HCP标准品和对应抗体所开发的检测方法。当一个项目在上游条件相似时可用相同方法进行HCP检测。图2B表明，如果在产品开发时已有基于平台工艺的HCP方法，则此方法可用于产品开发的所有阶段。如果细胞培养工艺与平台工艺发生显著变化，并且可能引入显著不同的HCP群体，则在临床三期/工艺验证之前需要切换到专属HCP方法。

图2 USP<1132> 产品开发不同阶段HCP分析方法的选择策略

A：在产品开发开始之前没有平台HCP分析方法   

B：在产品开发之前已有平台HCP分析方法

二. HCP抗原制备

2.1 空载细胞培养

第一步是建立一个不表达产物基因的空细胞，方法是使用与用于单独生产产物的细胞同源的未转染（即亲代）细胞，或使用不含产物编码基因的载体转染的生产细胞系。后者的主要优点是表达选择性标记（例如二氢叶酸还原酶或谷氨酰胺合成酶），另一个优点是模拟转染的空细胞更接近于制造过程的细胞培养条件下生长。使用空载质粒转染的生产细胞系,在接近于生产工艺的细胞培养条件下生成HCP。

由于细胞活率、代谢和密度的变化都可能改变抗原的HCP谱，因此可以略微更改细胞培养来产生不同的HCP组合（例如，允许发酵时间更长、人为改变培养条件及降低细胞存活率等），以获得更宽的HCP谱。

HCP抗原可以从代表性的小规模、中试规模或生产规模中产生。中试或生产规模可以最好地模拟实际工艺。然而，如果仅应用一次大规模生产，可能无法反映细胞培养过程中的正常变化；相反，可以合并几个小规模生产，以更好地反映细胞培养过程不同引起的变异性。

2.2 HCP收获

HCP抗原可以从细胞裂解物、HCCF或两者的混合物中制备，如图3所示。如果抗原从HCCF制备，则可以延迟收获细胞，以允许更多细胞裂解并释放HCP，从而拓宽HCP谱。上游发酵工艺结束后，对所得HCP抗原进行最小程度的处理，以减少HCP的损失。通常选择与实际下游生产工艺相同或相似的HCCF步骤去细胞碎片，然后通过超滤/渗滤处理HCCF，置换缓冲液（例如PBS或HEPE）并浓缩。应尽量减少过滤滤膜对HCP的损失，例如使用10 kDa或更小分子量截留的滤膜。

图3 USP<1132> 哺乳动物HCP抗原制备的典型过程

2.3 HCP质量分析建议在免疫前进行几项分析：

1）蛋白质含量：测量蛋白质浓度以确定未来使用的标准浓度并确定制备的抗原的总量。总蛋白质测定最常用的方法是双辛可宁测定法（BCA）、布拉德福德测定法和氨基酸分析法（AAA）；

2）不存在产物（如蛋白质印迹、免疫测定和/或MS分析所示）；

3）通过1-D或2-D聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）表征，确定存在尽可能多的HCP蛋白（图4）。

图4 哺乳动物细胞HCP SDS-PAGE电泳图

HCP抗原除了作为免疫原，也需要作为标准品使用，因此还要确保：

1）生产量应足够大，以提供多年（通常为10-20年）库存；2）抗原制备过程应详细记录，以便于后期再生产时的回溯；3 ）HCP抗原组成也应足够全面，以耐受产品生命周期内的工艺制造变化；

4 ）HCP标准品应进行稳定性监测，避免发生降解。

三.HCP抗体制备

3.1动物免疫与血清纯化

由于制备的抗HCP抗体使用期限可能较长（例如产品或平台的预期生命周期较长），因此所制备的抗体应尽可能多。由于CHO为哺乳动物细胞，因此使用在系统发育树上离哺乳动物更远的物种（如鸡）有助于产生针对哺乳动物保守蛋白的抗体，有助于提高抗体覆盖率。在免疫接种之前，应确认动物是否对产品药物存在预先免疫抗体，应排除反应阳性的动物。

每只动物可进行多次增强免疫，以产生高滴度、高亲和力抗体。低分子量HCP抗原往往免疫原性差，也可单独收集低分子量HCP抗原，然后实行不同的免疫策略以增强免疫效果。在合并抗血清前应对每个个体的血清进行滴度或Western blot分析，以筛选和去除低滴度、仅对部分HCP具有免疫反应以及非特异性结合的抗体。

纯化血清中抗体时，选择不同的纯化方式会有不同的效果（如图5），最终获得的抗体库也应证明HCP的覆盖率与专属性。

图5 USP<1132> 抗体的不同纯化方法优缺点

3.2 HCP抗体的覆盖率研究

覆盖率评估方法有两种：二维电泳结合蛋白质免疫印迹（2-D Western blot）或免疫亲和捕获。USP<1132>对抗体覆盖率评估的2种方法进行了对比（图6）。事实上，目前抗体覆盖率的检测在这两种原理的基础上，衍生出更多的检测方法。

图6  USP<1132>二维电泳结合蛋白质免疫印迹与免疫亲和二维电泳方法比较

3.2.1 2-D+Western blot

使用两块同样的胶对同一样品进行二维电泳，其中一块进行Western blot显色，另一块用银染/荧光染色；再用软件匹配分析两块胶中的蛋白质点，计算覆盖率水平（图7）。该方法操作较为简便，但是重复性差、数据比对分析困难；且方法中HCP处于变性条件下，与ELISA检测中的HCP的天然状态不同（图8）。

图7 2-D Western blot覆盖率分析流程图

图8 USP<1132>覆盖率对比示意图

左图：CHO HCP的2-D SDS-PAGE荧光染料染色

右图：与左图相同样品的Western blot分析

3.2.2 荧光差异印迹电泳技术（DIBE）

差异荧光印迹电泳技术可以实现一个样本，只需制备一块凝胶，最终在同一张印迹膜上，展示两个荧光通道，一个是HCPs总蛋白，另一个被抗体识别覆盖的HCPs。DIGE/DIBE技术避免了胶间差异和凝胶形变，配合HCP专用分析软件，自动胶点匹配，2D/3D全程跟踪式显示匹配效果，并且直接计算覆盖率结果。该方法规避了使用两块凝胶之间存在的客观或主观差异。

图9 使用不同荧光标记的DIBE法

3.2.3 免疫亲和二维电泳

免疫亲和二维电泳是基于免疫层析柱和二维电泳的方法。首先将HCP抗体偶联到层析填料上，然后上样HCP样品，过程中HCP抗体可捕获识别的HCP，而未识别的HCP则会流穿，最后洗脱富集HCP。分别将捕获前和捕获后HCP进行二维电泳银染分析，计算抗体的覆盖率（图10）。

图10 免疫亲和二维电泳流程图

3.2.4 免疫亲和-液相质谱（LC-MS/MS）分析

在免疫亲和的基础上，也可使用LC-MS/MS进行覆盖率分析，并且可以定量分析HCP。LC-MS/MS方法有几个优点：

1）可以在产品开发的早期鉴定潜在的高风险HCP；

2）可以确定单个HCP的相对水平。但由于最终产品中的单个HCP水平非常低，对此方法的灵敏度提出了非常高的挑战。

3.2.5 基于免疫磁珠的的2D/MS分析

磁珠一般具有超顺磁性，在磁场作用下实现结合、未结合蛋白快速分离，简化操作，缩短反应时间。磁珠表面通过外部修饰的功能基团结合活性蛋白，作为抗原抗体反应的载体，与其形成复合物，具有强磁响应性，在磁力的作用下定向移动，使复合物与液体中其他物质分离，达到分离、浓缩、纯化特异性蛋白的目的。对于HCP抗体覆盖率检测，则是把HCP抗体偶联到磁珠上，将HCP样本与磁珠共同孵育，过程中HCP抗体捕获结合可以识别的HCP，而未识别的HCP则因不会捕获而被洗涤步骤清除，最后通过低pH等洗脱条件收集能识别的HCP。将捕获前HCP样本和捕获洗脱样本分别进行二维电泳和银染显色分析，计算获得抗体的覆盖率。

该方法最大的特点是利用了免疫磁珠的半液态性质，可以在悬浮的条件下与HCP样品充分混匀结合，与ELISA检测条件一致，HCP无需变性处理，并且结果重现性非常好。由于捕获效率高，抗体的使用量也相对较少，具有操作简便，可实现自动化的显著优势。

图11免疫磁珠与蛋白质结合作用过程