毕赤酵母表达系统的应用

引言

       随着蛋白异源表达的飞速发展，越来越多的表达系统被建立并得到应用。尽管科研人员在寻找表达载体方面做出了诸多努力，但是目前主流的表达体系仍然是由大肠杆菌、酵母、昆虫细胞以及动物细胞等构成。

       大肠杆菌体系的优势在于其结构简单，操作方便，外源蛋白表达量高，大规模生产成本较低；其缺点也同样明显那就是没有糖基化修饰能力，且胞内易形成包涵体。

       酵母体系的优点主要是兼具原核细胞良好的可操作性和真核系统的后加工能力，但存在产量低及过度糖基化等问题。

       昆虫细胞的优点主要是具有高等真核生物表达系统的优点，产物的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，但糖基化程度较低,形式单一。

       哺乳动物细胞系统的有点主要是产物的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质最接近，糖基化等后加工最准确,但表达水平较低。

       大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往往形成没有活性的包含体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。

       近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快、易于培养、遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物表达时蛋白质进行正确加工、修饰、合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。

       酵母表达系统包括酿酒酵母表达系统、甲醇酵母表达系统以及其他酵母表达系统。以甲醇营养型酵母(Methylotrophic yeast)毕赤酵母为代表的第二代酵母表达系统，能够将甲醇作为唯一碳源，是近年来被公认的最有效的外源蛋白表达系统之一，已有多种外源蛋白在该宿主系统中获得了成功表达。作为生产外源蛋白的重要宿主菌，依靠其各种不同功能的表达载体，已经得到广泛应用。表达的蛋白质包括酶、 膜蛋白、抗原、抗体和调节蛋白等。

作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与 E.coli 及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物细胞培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价且表达水平更高。同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍，这使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。

       毕赤酵母表达系统在多个领域中都有广泛的应用。其中，医药领域是应用最广泛的领域之一。首先，毕赤酵母表达系统可用于生产各种重组蛋白药物。目前该表达系统已有15种被FDA批准上市的蛋白质药物，如Cervarix 疫苗、细胞因子 IFN-γ、GM-CSF 等。这些药物又广泛用于预防与治疗肿瘤、炎症、自身免疫病等疾病；其次，毕赤酵母表达系统也可用于酶工业生产。由于毕赤酵母菌株具有高效的蛋白质分泌能力，所以毕赤酵母表达系统广泛应用于工业发酵中，尤其是酶制剂的生产中。例如，葡萄糖氧化酶是生产氢氧化物的重要酶制剂，在其生产过程中采用毕赤酵母表达系统，可将生产效率提高数倍，成本也更低；最后，毕赤酵母表达系统还可以应用于食品加工行业。因为可以在毕赤酵母细胞内表达出多种人工蛋白吸附剂和食品增稠剂，所以毕赤酵母表达系统在食品加工行业中经常被使用。例如常见的一种食品增稠剂-Xanthan gum 就是由毕赤酵母表达制备而成。

       毕赤酵母系统的广泛应用，原因在于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还有以下几个优点：

       ①具有醇氧化酶AOX1基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一；

       ②表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合；

       ③菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高；

       ④毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可免受蛋白酶的讲解，而且减少对细胞的毒害作用。

       中国药典2020 版三部规定，以细胞基质生产的生物制剂DNA残留量不能超过100 pg/剂，以细菌或真菌基质（酵母、大肠杆菌等）表达的生物制品中DNA 残留量不超过10 ng/剂。

       美国FDA发布的指导原则中指出生物制品宿主细胞DNA残余限度为100 pg/剂，对于大剂量生物制品如单克隆抗体，根据其残留DNA来源及给药途径，DNA残留量可放宽至10 ng/剂。

       欧洲药典通则规定的生物制品残留DNA限度大多为不超过10 ng/剂，但对个别疫苗的残留DNA限定标准更严格，如甲型肝炎灭活疫苗中的DNA残留量不得超过100 pg/剂，乙型肝炎疫苗中的DNA残留量不得超过10 pg/剂 。

       君研生物依托相关法规，自主研发了毕赤酵母残留 DNA（qPCR）检测试剂盒。该试剂盒配套有毕赤酵母DNA 定量参考品可快速准确定量检测各种生物制品及药品的中间品、半成品和成品中毕赤酵母残留DNA 含量。试剂盒的线性范围为：300pg/µL-0.03pg/µL。