科研干货 丨 细胞与基因治疗——慢病毒载体以及滴度检测

从上世纪90年代以来，借助病毒感染真核细胞，成为了实验中转移遗传物质的重要手段。其中，由于慢病毒能感染的细胞类型广泛（包括分裂与不分裂细胞，干细胞等），可携带不于5 kb的外源基因，并具有稳定插入宿主基因组等优势，成目前主流的工具病毒。慢病毒属于逆转录病毒科的RNA病毒，慢病毒载体是以HIV-1为基础发展起来的基因治疗载体。慢病毒转导基因的优点在于不仅可以感染多种分裂和非分裂细胞且能够高效的将目的基因整合到宿主基因组中并长期稳定表达在一些特定的实验中，我们需要为病毒滴度，进行测定。

那么什么是病毒滴度呢？就像重组蛋白合成以后需要检测纯度一样，病毒包装后的效力如何，如何定量，也是必须要检测的，专业术语称为：病毒滴度的测定。慢病毒滴度是用于评估转导一定数量靶细胞所需要的病毒数量，即每升溶液中含有的病毒数量。转导单位(TU)即能够感染并整合到细胞内的病毒载体基因组。常规生产的病毒的滴度在2x10E8TU/ml之间。所以，在慢病毒研究过程中，有效实现病毒滴度的检测显得尤为重要。下面我们就来聊下几种常见的慢病毒载体滴度的检测方法。

图1 慢病毒收集流程图

常用的检测方法有荧光染色法、流式细胞术法、荧光定量PCR法、p24 蛋白酶联免疫法（ELISA）等。

利用病毒进行抗原-抗体结合反应显色或慢病毒载体携带其他Marker Gene，如RFP\BFP可以用荧光显微镜在对应的激发光波长下观察荧光表达的情况。有直接法和间接法两种（如图二）。

图二 荧光染色法 

慢病毒感染靶细胞的感染效率可以通过Real-time PCR检测靶细胞中的慢病毒载体拷贝数来测算。所谓Real-Time PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。real-time PCR技术即实时荧光定量PCR避免了传统PCR以终产物监测定量产生的偏差，提高实验的重复性。该技术已经被广泛用于监测细胞mRNA表达量的变化;比较不同组织的mRNA表达差异;验证基因芯片，siRNA干扰的实验结果。

该方法检测的是病毒的物理单位。p24蛋白是慢病毒外壳中含量最大的标志性蛋白（见图三）。一般而言，p24蛋白ELISA检测能检测所有p24蛋白，从而实现对病毒滴度的定量。采用ELISA方法，反应灵敏，可检测1 ng/mLHIV p24蛋白，最后分光光度计读取数据。研究表明，每个LV大约含有2000个p24蛋白分子，1ng的p24相当于1.25×10⁷个慢病毒物理颗粒（LP）。

图三  HIV病毒颗粒结构示意图

中检院与CDE发布的《CAR-T细胞治疗产品质量控制检测研究及非临床研究考虑要点》和《基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则》等相关指导原则中明确指出: 病毒载体中需要通过p24抗原含量检测病毒载体的颗粒数量。

2022年05月，国家药品监督管理局颁布了《体外基因修饰系统药学研究与评价技术指导原则（试行）》，指导原则对慢病毒载体质量研究与控制有着全面的要求其建议对慢病毒载体进行滴度检测。同时该指导原则指出应考虑采用多种方法进行病毒滴度的检测，并积极探寻不同检测方法间检测数值的相关性。因此，在进行慢病毒滴度检测方法的研究时，流式检测法、ELISA 检测法及 qPCR 法可结合使用，以提高检测结果的可靠性。

君研生物的P24蛋白检测试剂盒，线性范围为15ng/ml-0.0617ng/ml，灵敏度达0.02ng/ml，大大降低样本的稀释倍数，减小实验误差，检测时间短，只需1h15min，方便快捷，可更好的实现高效率的慢病毒滴度质控检测。

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