科研干货｜宿主细胞蛋白（HCP）检测概述

前言：近年来，生物药企开始将更多的注意力投向生物制品制造过程中宿主细胞蛋白（HCP）的检测。在不同生物制品中，宿主细胞蛋白（HCP） 的存在取决于许多参数，包括用于制造的细胞系的选择、产品本身的特性、培养持续时间和细胞活力等，所以检测HCP残留成为一项十分重要且具有挑战性的工作

01 宿主细胞蛋白（HCP）概述

02 HCP检测相关法规要求

HCP残留是工艺稳定性监测的重要评价指标，是重组疫苗及重组抗体类药物的重要质控指标，生物制品中残余HCP含量通常被认为是产品的关键质量属性 (CQA)。诸如FDA和EMA之类的国家法规授权要求必须对生物药品进行分析和纯化，以将宿主细胞蛋白HCP降低到可接受的水平。对HCP的接受程度将根据具体情况进行评估，并取决于多个因素，其中包括：剂量、给药频率、药物类型和疾病严重程度。美国FDA推荐值：1-100ppm（ppm：百万分之一），中国药典明确规定CHO细胞残余蛋白占总蛋白含量要保持在0.05%以下（相当于小于500ppm）。

03 HCP研究面临的挑战

即使是最终药物中少量的宿主细胞蛋白(HCPs)也能产生免疫原性反应; 因此，需要对产品和工艺中间体进行检测。传统的蛋白质检测方法，如高效液相色谱法和总蛋白染色法，不具有HCP检测所需的灵敏度和特异性。优化的免疫分析(ELISA)和质谱(MS)方法更适合于HCPs的测量和表征。

04 HCP检测、鉴定和定量的分析方法

现已有多种分析技术来了解生物过程中存在的HCP 及其丰度，具体如下：

酶联免疫吸附测定法（ELISA）

该方法是多国药典中用于测量总HCP浓度的常规方法，具有高效便捷等特点。然而，在此种测定方法中，对于动物中的非免疫反应性或弱免疫反应性蛋白质可能存在漏检现象；此外，此种方法不能用于定义存在哪些HCP组分，以上表明了此方法的局限性。

2D-PAGE/2D-Western blot

这是一种通过凝胶将HCP分离为单组分的方法，主要可以对HCP的组成进行定性分析，但是这种方法的局限性在于会出现丰度高的蛋白点遮挡丰度低蛋白点的情况（即未完全分离开），造成分析不准确。另外，灵敏度依赖于不同的染色技术。2D-PAGE结合蛋白质印迹也可以识别特定的HCP，但这种方法的通量不高且耗时。

液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）

质谱法可以检测同一样品中许多蛋白质的存在。这种方法可以提供一定程度的定量，并比较不同样品中的蛋白质含量。然而，在高度纯化的重组蛋白样品中，残留 HCP 检测需要高灵敏度的仪器和熟练的操作员，并且与低水平的 HCP 相比，存在大量重组蛋白可能会变得复杂。此方法仍然无法对所有存在的 HCP 进行全面检测。    

虽然上述单一方法均无法准确、高效的测定HCP，但可以将不同的检测技术组合。如将ELISA与2D-PAGE组合，并使用免疫印迹技术，可以验证ELISA中抗体的覆盖率，有助于提高ELISA方法的准确性。2D-PAGE也可以结合LC-MS/MS ，以此识别特定的 HCP组分，有助于识别高风险因子。

多种HCP检测、鉴定和定量的分析方法对比

05 ELISA应用于HCP检测  

开发的早期阶段，可接受通用的商用试剂盒用于检测HCP，但一旦生物制药进入三期临床试验阶段，由于通用试剂盒的抗体覆盖率不足等局限性，就需要一种经过验证的、产品特异性的HCP检测方法。开发这种产品特异性检测方法是一个耗时的过程，涉及多个步骤，包括抗血清生产、抗体纯化、ELISA方法的建立和优化、确认和验证。一般开发方向有三个：通用型检测、平台化检测以及项目专属性检测，这三种方向的对比如下图所示：

不同类型ELISA检测方法比较