科研干货丨浅谈SV40基因残留危害

        随着相关技术指导与监管体系的日益完善，细胞与基因治疗（Cell and Gene Therapy, CGT）行业发展迅速。

       大多数治疗性生物分子药物都是在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中生产的。然而，鼠源细胞与人源的HEK293细胞相比，缺乏人的细胞翻译后修饰系统，因此与人源系统表达的蛋白有差异。所以，一些重组蛋白在HEK293中生产效果更好，且大多数治疗性病毒载体也是在HEK293中产生的。随着CGT疗领域的不断发展，HEK293及其衍生细胞在病毒载体生产中的应用也将越来越广泛。

本文中，我们主要谈论293T细胞中的SV40基因。

图为HEK293细胞衍生图谱

        SV40是最著名的小型DNA双链病毒，在20世纪70-80年代，由于SV40非常容易进行培养，而且由于很小的病毒基因组大小，容易进行遗传操作，同时，SV40可以当做模型用来研究癌变的相关机理。因此SV40得到了空前的研究。

SV40是小的非包膜病毒颗粒，二十面体的结构，在衣壳里面的是病毒DNA基因组，DNA被组蛋白缠绕，形成类似核小体的结构物。

293细胞是转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系，293T细胞由293细胞派生，同时表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以复制。瞬时转染293T细胞是过表达蛋白并获得细胞内及细胞外（分泌的或膜）蛋白的便捷方式。 

图（A）为SV40病毒结构模拟图，图（B）为SV40显微观察图

        SV40病毒基因组早期基因编码两种肿瘤抗原（tumor antigen,T抗原），其分子量分别为94000（大T抗原）和17000（小T抗原）。T抗原有以下的作用：①大T抗原为细胞转化的启动所必需；②转化细胞表型的维持必需要有大T抗原的连续表达；③小T抗原对于细胞的转化不是必需的,但可起加强作用。SV40病毒引起的转化是一个复杂的过程，现知SV40的大T抗原大部存在于转化细胞的核内,与核质、染色质和核的基质联结在一起。

        1979年，Lane和Crawford在感染了SV40的小鼠细胞内分离获得一个与SV40大T抗原相互作用的蛋白，因其分子量为53 kDa，故而取名为p53（人的基因称为TP53）。p53基因是迄今发现与肿瘤相关性最高的基因。p53基因是一种重要的抑癌基因，它是细胞生长周期中的负调节因子，在细胞周期调控、DNA损伤修复、细胞分化、凋亡和衰老等许多过程中。SV40的大T抗原的互作，导致p53功能异常，这些DNA损伤的细胞就可能逐渐脱离正常的调控，有可能最终形成肿瘤。

SV40的监管机制The regulatory mechanism of SV40

        CDE（国家药品监督管理局药品审评中心）最新颁布的2022年5月的《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》和《体外基因修饰系统药学研究与评价技术指导原则（试行）》中都提到包装病毒载体用细胞库，如HEK293T细胞，对其携带的具有潜在安全性风险的Adv E1A序列和SV40大T抗原序列，均应进行残留控制。

随着生物技术的发展，多种病毒载体被用于基因细胞治疗产品的研发和生产中，而对于产品中已知的、具有潜在安全风险的特定转化序列，如HEK293T细胞携带的E1A序列和SV40大T抗原序列，应分别进行残留控制，减少不可控的危险因素。 

君研生物自主研发的 E1A&SV40LTA残留 DNA(qPCR)检测试剂盒采用多重荧光定量PCR法定量检测半成品、中间品以及成品中E1A和SV40LTA的DNA残留。本试剂盒与君研生物宿主细胞残留 DNA 样本前处理试剂盒配套使用，可准确定量样品中残留的微量 E1A和SV40LTA DNA。

• 精密度高：低浓度重复性CV值<20%；中高浓度重复性CV值<15%

• 覆盖广泛：试剂盒内含非线性化及线性化两种参考品，供客户选择

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