科研干货｜病毒载体与HEK293细胞

人胚胎肾细胞（HEK293）有着稳定生长，高转染效率以及能够表达高滴度病毒的优势，所以广泛用于表达重组病毒和重组蛋白。

基因治疗作为生物制药领域最炙手可热的“明星”之一，被给予极高的期待，作为一种新型生物药物，递送系统的选择与药物的疗效和价格密不可分，目前主要可以分为两大类，一类是病毒载体（以AAV为代表），一类是非病毒载体（以LNP为代表）。由于病毒载体具有较低的免疫反应和优秀的递送效率，目前有三分之二的临床试验选择以病毒载体作为递送系统。

HEK293细胞/三质粒系统是AAV生产的主流系统：AAV生产系统包括HEK293细胞/三质粒系统和依赖于昆虫杆状病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒或痘病毒的包装系统。以HEK293细胞/三质粒系统和昆虫杆状病毒系统最为常见，但由于昆虫杆状病毒系统的单个细胞生产效率低、病毒活性低等特点，目前业内最主流的还是采用HEK293细胞/三质粒生产系统。

HEK293细胞的悬浮驯化到最终的悬浮放大生产过程中的关键步骤。

1.第一步：对HEK293细胞进行悬浮驯化

将HEK293细胞复苏至含有10%FBS的ATCC-Formulated Eagle’s Minimum Essential Medium中；贴壁传代培养，将培养基换成DMEM，并逐步将FBS浓度从10%降低至2.5%；悬浮驯化切换至挡板摇瓶中，培养基换成无血清的培养基HyCell TransFx-H；对成功悬浮的HEK293细胞进行冻存建库（MCB）。

2.第二步：转染悬浮HEK293细胞

将细胞密度稀释至1E6 cells/mL；使用FreeStyle F17配制转染复合物为终体积的5%。DNA浓度为1.0μg/mL，其中三质粒（pAAVRC2:pHelper:pAAV-GFP）的比例为1:1:1，PEI:DNA的比例为2:1；37°C下，将转染复合物液体加到悬浮的HEK293细胞中进行转染；转染结束后加入终体积10%的CDMEHEK293进行稀释终止转染，防止PEI引起的细胞聚集。

3.第三步：对HEK293细胞进行悬浮放大生产

为验证该悬浮HEK293细胞生产的可放大性，可在5 L/Wave一次性反应袋中进行小批量放大实验：在HyCell TransFx-H基础培养基中加入4mM谷氨酰胺，对悬浮HEK293细胞进行培养；培养四天后，在培养基中再次添加3.5mM的谷氨酰胺培养继续培养，直至收获细胞。

4.总结:

随着基因疗法的快速发展，市场竞争愈发激烈，如何快速地从实验室推进到商业化的转化，其中一个关键就是病毒载体生产工艺的优化。我们也注意到了病毒载体自身的局限性，但其在基因治疗商业化中的主导地位短时间内依旧是无法撼动的。因此，本文通过对HEK293细胞悬浮驯化中各关键条件的优化，最终成功地进行放大生产。