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2023年4月，USP推出了第二版指南，以收集全球利益相关者的进一步反馈。在这一阶段，USP积极就修订后的mRNA指南草案征求公众意见，接受来自不同利益相关者的意见以及几种捐赠的方法。随着第三个版本的发布，USP已经细致地处理了公众的意见，并将捐赠的方法纳入了指南。此外，USP还对一些关键质量属性（CQA）的方法进行了评估，并将这些方法纳入了指南草案。
将之前版本的表1替换为一个新版本，改编自USP第<1040>章，已在药理学论坛上发表。
添加捐赠LC-MS方法--5的盖帽效率
添加捐赠LC-MS方法--3‘聚(A)尾巴长度
更新免疫印迹方法
通过AEX-HPLC在mRNA法中添加残留的NTPs和盖帽剂
LC-MS法---3‘聚(A)尾长度
免疫印迹法---dsRNA杂质
封盖剂法---残留NTPs和mRNA
CGE法---mRNA完整性
IP-RP-HPLC法---mRNA纯度
目前，有几种可以制造mRNA药物物质的方法，包括使用PCR生成的模板或具有终止子序列的非线性化质粒。该mRNA制药物质模板可通过宿主细胞（如大肠杆菌）扩增制备。在任何一种情况下，用于制造mRNA疫苗的每一批质粒DNA，都必须在释放前进行测试，以确认其身份、纯度和质量。质粒DNA被认为是GMP水平的起始材料，必须从细胞库初始阶段开始按照GMP的原理生产。管理细胞库和测试建议的最佳实践在通用章节<1042中描述了关于重组生物制剂的>细胞库实践。
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Table 1:Plasmid DNA Quality Attributes,USPChapter<1040> 表1：质粒DNA质量属性USP<1040>章节 |
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QualityAttribute 质量属性 |
Analytical Procedures 分析程序 |
Example Acceptance Criteria² 验收标准示例a |
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Appearance-color and clarity 外观——颜色和清晰度 |
Visual Inspection from (631)or Ph.Eur2.2.2 目视检查 (631)或Ph.Eur2.2.2 |
Clear,colorless solution but may be molecule and/or process specific 透明，无色溶液，但可能是分子和/或工艺特定的 |
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Visible particulates 可见微粒 |
〈790〉,c〈1790〉d, Ph. Eur. 2.9.20, Ph. Eur.2.9.19 |
Free of visible particulates 无可见微粒 |
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pH |
(791)e |
End use-specific 最终特定用途 |
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Concentration 浓度 |
A260 |
End use-specific 最终特定用途 |
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Size exclusion HPLC 分子排阻HPLC |
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ldentity 鉴别 |
Restriction map 限制性内切酶图谱 |
Identical to theoretical or identical to reference map 与理论图谱或参考图谱相同 |
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Sequencing 测序 |
Identical to reference sequence 与参考序列相同 |
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ldentityof homologous regions including long terminal repeats(LTRs), inverted terminal repeats (TRs),and poly(A)tails 同源区域的识别，包括长末端重复序（LTRs）， 反向末端重复序列（ITRs ），和多聚(A)尾 |
Restriction map 限制性内切酶图谱 |
The integrity of these regions should be understood as part of the overall control strategy. 这些区域的完整性应被理解为整体体控制策略的一部分。 |
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PCR |
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Sequencing 测序 |
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Plasmid DNA topology 质粒DNA拓扑结构 |
Agarose gelelectrophoresis 琼脂糖凝胶电泳 |
Criteria should be end use-specific.Hereare some possible attributes of interest:Control for appropriate percentage total supercoiled with low percentage of open circular,linear,and other forms 标准应该是特定于最终使用的。这里有一些可能的兴趣属性：控制适当的百分比总超卷曲与低百分比的开圆形，线性和其他形式 |
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Anion exchange (AEX)HPLC 阴离子交换（AEX）HPLC |
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Capillary gel electrophoresis (CGE) 毛细管凝胶电泳（CGE） |
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Analytical ultracentrifugation 分析性超离心 |
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Electron microsCOpy 电子显微镜 |
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Residual protein 蛋白残留 |
Colorimetric [eg,bicinchoninic acid (BCA),Lowry] 比色法（例如二喹啉甲酸法（BCA）， Lowry] |
End use-specific;1-10%(w/w)f 最终特定用途；1-10%（w/w）f |
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Hostcell protein enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) 宿主细胞蛋白酶联 免疫吸附试验（ELISA） |
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Residual hostDNA 宿主DNA残留 |
Quantitative polymerase chain reaction (PCR) 定量聚合酶链式反应（PCR） |
End use-specific;1-10%(ww)f 最终特定用途；1-10%（w/w）f |
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Residual hostRNA 宿主RNA残留 |
Agarose gel electrophoresis (AGE)with an appropriate stain 琼脂糖凝胶电泳（AGE）与适当的染色 |
End use-specific;1-10%(w/w)f 最终特定用途；1-10%（w/w）f |
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Fluorescent labeling of RNA measured by fluorimetry 用荧光法测定RNA的荧光标记 |
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Reverse phase HPLC RT-PCR 反相HPLC 反转录酶-聚合酶链式反应 |
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Residual antibiotic(s) 抗生素残留 |
ELISA |
End use-specific;consider both patient and environmental safety 最终用途；考虑患者和 环境安全 |
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Mass spectrometry 质谱法 |
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Reverse phase HPLC 反相HPLC |
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Endotoxins 细菌内毒素 |
<85>9 |
End use-specific;s10-100 EU/mg 最终特定用途；≤10-100EU/mg |
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Bioburdenh 微生物限度h |
<61> |
Enduse-specific;in general,s1 CFU/10 mL 最终用途；一般，≤1 CFU/10 mL |
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Sterility h 无菌h |
<71>j |
No growth [NOTE—Scale of manufacturing may make sampling per 〈71〉 dificult. See 5.1.12 Bioburden and Sterility for more details.] 没有增长[注:生产规模可能使按< 71 >抽样变得困难详细信息请参见5.1.12微生物限度和无菌] |
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Mycoplasma k 支原体k |
<63>l |
Should not be present in microbial generated plasmid DNA. Testing is optional de- pending on application. May be a requirement to rule out human contamination. 不应存在于微生物产生的质粒DNA中。测试是可选的，取决于应用程序。可能是排除人为污染的必要条件。 |
a Example acceptance criteria are provided when available, unless it is so specific and specific to the process (end use-specific).
b Color and Acromicity <631>
c Visible Particulates in Injections 〈790〉.
d Visual Inspection of Injections 〈1790〉.
e pH <791>.
f May need to consider patient safety guidelines when setting these limits.
g Bacterial Endotoxins Test <85>.
h Testing of both bioburden and sterility are not needed. One or the other should be chosen based on application and agreement with health authorities. If sterility is the testing approach that is chosen, sampling per <71> might not be feasible due to manufacturing scale, etc. See 5.1.12 Bioburden and sterility for more details.
i Microbial Enumeration Tests <61>.
j Sterility Tests <71>.
k Mycoplasma does not infect prokaryotic cells, so by default it should not be present in plasmids prepared from microbial sources. However, this test may be required for entry of the DNA
starting material into eukaryotic manufacturing facilities and by regulatory authorities.
l Mycoplasma tests <63>.
本指南提供了评价批量纯化mRNA药物原料和成品表征和放行检验的质量属性方法，具体见下表
下表红色加粗内容为第三版新更新内容
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质量 |
属性 |
方法 |
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鉴别 |
mRNA序列鉴定确认 |
高通量测序（HTS） |
|
桑格测序 |
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逆转录-PCR（RT-PCR） |
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浓度 |
RNA浓度 |
定量逆转录PCR（RT -qPCR） |
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逆转录数字PCR（RT-dPCR） |
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紫外分光光度法（UV） |
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完整性 |
mRNA完整性 |
毛细管电泳D |
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毛细管凝胶电泳（CGE）D |
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琼脂糖凝胶电泳 |
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纯度 |
mRNA纯度 |
离子对反相高效液相色谱法（IP-RP-HPLC） |
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5‘加帽效率 |
反相液相色谱质谱（RP-LC-MS/MS）D |
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离子对反相高效液相色谱法（IP-RP-HPLC） |
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液相色谱质谱法（LC-MS/MS）D |
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3‘poly (A)尾长 |
液相色谱质谱法（LC-MS/MS）D |
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|
离子对反相高效液相色谱法（IP-RP-HPLC） |
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产品相关杂质- dsRNA |
免疫印迹法 |
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|
酶联免疫吸附试验（ELISA） |
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产品相关杂质-聚合体定量 |
分子排阻-高效液相色谱法（SEC-HPLC）D |
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产品相关杂质-片段mRNA的百分比 |
反相液相色谱法（RP-HPLC）D |
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工艺相关杂质-残留DNA模板 |
定量PCR（qPCR） |
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工艺相关杂质-游离/非结合核苷的定量 |
反相液相色谱质谱（RP-LC-MS/MS）D |
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工艺相关杂质-残留的NTP和封盖剂 |
阴离子交换的高性能液体
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工艺相关杂质-残留的T7 RNA聚合酶含量 |
酶联免疫吸附试验（ELISA） |
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效力 |
靶蛋白的表达 |
基于细胞的测定 |
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安全 |
细菌内毒素 |
USP <85> |
|
微生物限度 |
USP <61>, <62>, <1115> |
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|
其他 |
外观 |
USP <790> |
|
残留溶剂 |
USP <467> |
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|
pH |
USP <791> |
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质量 |
属性 |
方法 |
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鉴别 |
RNA鉴定 |
桑格测序 |
|
逆转录酶-PCR（RT-PCR） |
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|
带电气溶胶检测器的反相高效液相色谱法（RP-HPLC-CAD） |
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浓度 |
RNA浓度/RNA包封效率 |
荧光检测 |
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磷脂含量 |
带电气溶胶检测器的反相高效液相色谱法（RP-HPLC-CAD） |
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完整性 |
LNP大小和多分散性 |
动态光散射（DLS） |
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RNA大小和完整性 |
毛细管凝胶电泳（CGE）D |
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纯度 |
与产品相关的杂质-聚合体定量 |
分子排阻-高效液相色谱法（SEC-HPLC）D |
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产品相关杂质-片段mRNA的百分比 |
离子对反相高效液相色谱法（IP-RP-HPLC）D |
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效力 |
靶蛋白的表达 |
基于细胞的测定 |
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安全 |
细菌内毒素 |
USP <85> |
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无菌 |
USP <71> |
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|
其他 |
外观 |
USP <790> |
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残留溶剂 |
USP <467> |
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渗透压 |
USP <785> |
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可见异物 |
USP <787> |
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抽提体积 |
USP <1>, <698> |
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容器封闭完整性 |
USP <1207> |
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pH |
USP <791> |
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